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长叶地榆化学成分研究

归档日期:08-20       文本归类:地榆      文章编辑:爱尚语录

  贵州大学硕士学位论文 长叶地榆的化学成分研究 姓名:徐耀 申请学位级别:硕士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:郁建平 20080301 贵州大学2008届硕士学位论文 摘要 长叶地榆(Sanguisorbaoj庐cinalis Lvar long@lia一(Bert)Yu et Li)是蔷薇科 (Rosaceae)地榆属(SanguisorbaL)植物中的一个种,主要分布于中国东北、华北、 华东、广西及贵州等地,具有凉血止血,解毒敛疮之功效。本论文对长叶地榆化 学成分进行了系统的研究。 将长叶地榆的根茎的乙醇提取物依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,应用 色谱法分离氯仿部分和乙酸乙酯部分化合物,借助波谱技术(GC.MS、1H-NMR、 C)鉴定化合物的结构。 从氯仿部分、乙酸乙酯部分中共分离到13个化合物,目前完全鉴定了其中9 个化合物的结构,分别为:大黄酚(I)、大黄素甲醚(II)、畔}甾醇(111)、阿 ()。所有化合物均为首次从该植物中分离得到,并测定该植物中的有效成分的含量。总黄酮含量3.51%,而鞣质含量为9.60%。 关键词:长叶地榆 化学成分 结构鉴定 贵州大学2008届硕士学位论文 Abstract Sanguisorbaoj历cinalis L.vat longifolia(Bert)Yu etLi belongs tothe speciesof Rosaceaein Sanguisorba Landis mainly distributedin northeastnorthchinaeast c11i1地guangxiprovince guizhouprovinceete.This plant canbeusedtocoolblood stop bleeding detoxify.Thisthesismadea systemicstuay onthe chemical constituents ofSanguisorbaoffZcinalis LvaF longifolia(Bert)Yu etLi. TheEtOHextractsof Sanguisorbaofficinalis Lvat longifolia(Bert)Vu et Liwas extracted byCHCl3,EtOAc andn-BuOH byturns.Usingchromatographic methodsto isolate compounds from Sanguisorbao.ffTcinalisLvat longifolia(Bert)Yu etLiin CHCl3layer EtOAclayer spectralmethods(C-C.MS、1H-NMR、13C-NMR). Therewere13 compoundspurified fromthechloroform layer andEtOAe layer. The9 compoundshadbeenidentifiedat presentandtheyale chrysophanol(I), physcion(II),fl-sitosterol(1it),ferulicacid(IV),Ursolicacid(V),酬lieacid (),quereetin(VII),kaempfeml(),catechin().灿lcompounds wereisolated from SanguisorbaofficinalisLvar longifolia(Bert)Yu etLiforthefirsttime.Effective constituentsof SanguisorbaofficinalisLvar longifolia(Bert)Yu etLiintherootwere determined.Thecontentoftotalflavonoidswas3.51%andthecontentoftanninWaS 9.60%. Keywords: SanguisorbaoJ历cinalis 1I仃longifolia(Bert)VuetLi chemicalconstituents structure identifying 贵州大学2008届硕士学位论文 前言 现代疾病对人类的威胁正在或已经取代了以往的传染性疾病,医疗模式已由 单纯的疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式,各种替代医学和 传统医学发挥着越来越大的作用。化学药物由于毒副作用大、产生抗药性等,很 难满足人们日益提高的健康需求。因此,在全世界药品市场上,天然物质制成的 药品所占的比重越来越大,中药与天然药物在“回归自然”的世界潮流中再次焕发 出强大的生命力,越来越受到世人的关注。 现代科技的发展使化学成分的分离和鉴定速度大大加快。制备色谱技术、各 种逆流色谱技术、高分辨质谱和大功率核磁波谱仪的应用,使很多微量的新化合 物成功地得到了分离和鉴定。据不完全统计,从2005年1月到2006年9月,各 国学者从陆生植物、动物及海洋生物中分离得到化合物6000余个,其中新化合物 3600余个。常用中草药的化学成分及有效成分研究继续受到关注,苔藓、地衣、 真菌(包括内生菌)等低等植物化学成分,以及海洋生物的化学成分研究已经引 起足够的重视并取得了初步成果。随着这些分离和鉴定技术在中药与天然药物生 产和研究上的运用,推动我国中医药事业的不断发展,正在逐渐被世界所认可, 欧美国家对中医、中药的谨慎态度正在变得宽松。改革开放以来,我国中药产业 持续发展,已初步形成了一定规模的产业体系,成为我国国民经济和社会发展中 具有较强发展优势和广阔市场前景的战略性产业,因此中药及天然药物产业隐含 着巨大的市场潜力和商机。 我国是一个中药资源丰富的国家。20世纪90年代全国中药资源普查结果表明 (于海等,2005),我国现有的中药资源种类达12807种,其中药用植物11146种, 药用动物1581种,药用矿物80种。贵州省地处云贵高原,独特的地理条件和湿 润温暖的气候,非常适宜草药生长与中药材种植,使贵州成为我国四大中药材产 地之一。各地州市的中药材品种均在千种以上,是著名中外的地道药材之乡,素 享“黔地无闲草,夜郎多灵药”之美誉。据1983~1992年贵州省中药资源普查结果 (冉懋雄,2004),贵州有中药资源4294种,其中药用植物3927种、药用动物289 种、药用矿物78种。中药资源产藏量约6550万t,其中药用矿物约6350万t,药 胃植物约196万t,药用动物约1500t。贵州省的中药材不仅药用价值高,而且产 贵州大学2008届硕士学位论文业开发的前景广阔。五倍子、山药、刺梨、猕猴桃、鱼腥草、银杏、银耳、魔芋、 苦丁茶等的生产,目前即被列为绿色产业重点发展和培育的项目。目前,贵州中 药资源通过普查统计得到,贵州省4294种资源中实际利用的仅有250种左右(其 中80%来自野生采集)。贵州是一个多民族聚居的省份,有丰富的民族药资源。经 调查,以苗族为代表的贵州民族药资源达3000种以上,因此贵州具有广阔的民族 药发展空间。 贵州大学2008届硕士学位论文 附:学位论文原创性声明和关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在 做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全 意识到本声明的法律责任由本人承担。 日期一。拇‘月关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被 查阅和借阅;本人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) ……彳秒燧名唧嗍200年月 贵州大学2008届硕士学位论文 一、文献综述 1地榆属植物的研究概况 11地榆属植物简介 地榆属(SanguisorbaL)植物是蔷薇科(Rosaceae)多年生草本植物。喜生于 山坡、谷地、草丛以及林缘和林内。适应性很强,抗寒、耐早、喜光。除寒冷的 冬季外,其余季节均可长出新叶。在贫瘠、干旱的土壤中生长更旺。所以,地榆 的人工驯化栽培较为容易。主要分布于中国东北、华北、华东、广西及贵州,广 .布于欧洲和亚洲北温带(中药大辞海编写组编,1993)。地榆为我国常用中药,该 药在民间应用己有悠久的历史,疗效确切,具有很高的研究价值,地榆属植物共 有30多种,根据调查,计有8种植物供药用。中国药典(2000版)一部收载本品为 蔷薇科限osaeeae)植物地榆(Sanguisorbaofficinalic L)及长叶地榆(Sanguisorba officinalic L肼longifalia(Bert)Yu et Li)的干燥根。其同属地榆还有矮地榆 (S.filiformis),小白花地榆(S.parviflore),细叶地榆(51.tenuifalia),小地榆 (S.minor),高山地榆(S.alpinaBye),白花地榆(&sithcheness)(竺叶青,1995)。 1.2地榆属植物化学成分 地榆属植物所含的化学成分是三萜及其甙类,黄酮类,鞣质类,糖类,无机 微量元素。现代对地榆的研究也较多,国内对地榆属植物的皂苷类化合物及黄酮 类化合物作了大量分离工作,尤其是日本对地榆属植物的研究比较深入,对鞣质 类化合物作了较为系统的分离,并开发出中药产品。 1.2.1糖类 到目前为止,从地榆属植物中分离得到的糖类有阿拉伯糖、半乳糖、果糖、 葡萄糖、鼠李糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等低分子量糖(TakuoK,eta1.1989)。 1.2.2维生素及微量元素 地榆属植物中含有多种微量元素:Li,A1,Ca,Fe,舡,Cd,Hg,Be, Si, Co,C1, cr, Cu, sr, Ba, Mg, Mn,Zn, Mo等,和 丰富的维生素(余南才等,1994)。见下表1.1。 贵州大学2008届硕士学位论文 表1.1地榆属植物中的维生素及微量元素 Table1.. 。Thevitaminsandtraceelementsot Sanguisorbaojff2cinalicL 植物 内含维生素及微量元素品种 地榆 K+Ca2+M92+Na+Fe3+Cu2+Zn2+Vb2VkVcVE 细叶地榆 Ca2+K+M92+Vb2Vc 小地榆 Fe3+Vc VE 1.2.3黄酮及其甙类 法国、前苏联、韩国研究工作者在50--60年代对地榆属植物茎、叶、花中黄 酮类物质进行了研究(AzovtsevGH,et al,1969)。现已分离出的黄酮类物质有 山奈素一3,7-二鼠李糖苷和槲皮素.3-半乳糖.7.葡萄糖苷(程东亮,1992),槲皮素, 矢车菊甙,矢车菊双甙,茨菲醇,杨梅甙,花青甙,无色花青甙,黄酮醇以及儿 茶素(江苏学院,1997)。其黄酮类化合物中主要的结构类型是黄酮醇类衍生物, 以及花色素类衍生物,其结构式如下: GLOH 山奈蠢-3.7---mt李糖营0H 0H 1.2.4甾醇及三萜类地榆属植物根中含有大量三萜及其甙类,约2.4%q.O%。已分离出的化台物 有:地榆皂甙元、地榆皂甙I、II(YosikoI,eta1.,1971)、、、A、B、E(Karneeva LN,Izv Akad NaukSSSRSet Khim,1970)、熊果酸、19.去氢熊果酸、3D. 乙酰乌苏酸、3a,19a,24.三羟基乌苏酸、3.羰基坡曼酸、2.羰基坡曼酸、坡曼酸、 贵州大学2008届硕士学位论文3,11.二羰基坡曼酸、2.羰基坡曼酸.(28_1)p.D.葡萄糖甙、野樱皮甙、2-异丁羧 基19a,25.二羟基乌苏.1,屹.二烯.28.羧酸(姜云梅等,1993)、3B—D一吡晡葡萄糖 .2a,19a-二羟基乌苏.12一酸.28一p.D.葡萄糖酯、2a,3p,19a-三羟基乌苏.12.烯.28- 羧酸.p-O.半乳糖酯、野蔷薇甙、K萄lichogosldeF、2a,3a-二羟基乌苏一12.,19(29)- 二烯.(28_1)p.D.吡喃葡萄糖酯(刘向前,1993)、白桦脂酸(Oesa R,eta1.,1992)。 已分离出的甾体类化合物有B.谷甾醇、豆甾醇、胡萝卜甙(刘向前,1993)。该 类化合物主要为甾醇类衍生物,乌苏酸类衍生物及坡模酸类衍生物,其结构式如 乌苏馥绝韵皂苷元Pa1ic扯id-衡.o-口十毗喃葡萄暗苷. 1.2.5酚类和鞣质类地榆属植物根、茎中含鞣质酚类物质很高,达17%(刘向前,1993),这类物 质有很强的生理活性.主要用于止血、收敛、治疗烫伤等。已分离出这类物质有: (1)l,2,6.三.O.没食子酰基葡萄糖;(2)1,2,3,6-四一O一没食子酰基葡萄糖;(3) 2,3,4,6.四.O.没食子酰基葡萄糖;(4)1,2,3,4,6.五.O.没食子酰基葡萄糖 (NormkaGletal.,1983),其结构如下: 贵州大学2008届硕士学位论文 f1) (5)甲基…6O没食子酰基…13D吡喃葡萄糖:(6)甲基…6O双没食子酰基…13D吡喃葡萄糖;(7)甲基-4,6一二 O一没食子酰基一D.D一吡喃葡萄糖;(8)甲基.2,3,6一三.O.没 食子酰基…13D吡喃葡萄糖;(9)甲基一3,4,6-三.O.没食子酰基…13D吡喃葡萄糖; (10)q了基-2,3,4,6一四 O-没食子酰基…13D吡喃葡萄糖;(11)没食子酸一3一O.p.D.(6.O. 没食子酰基)吡喃葡萄糖(TanakaT,eta1.,1984),其结构如下: R1‘5)00。 (83 0CHj (7)00H: (8)0CH, (9)0Ctt3 (10)0c如 ‘11) -D一呋喃金缕梅糖(NormkaG1et al,1984),其结构如下: 贵州大学2008届硕士学位论文(12’) ‘13> Rl 11|D}120恕0H R2 RI(14)H-l (16)H-4B_G (17)H-5 a--6 (18)H-7 (19)EugenineG日HDP- R2 R3 l赴lD_P班IDP ,ocQHR4 (20—24)H-3,H.6,H一8,H-9,H-10,H-11(CA,211091),其中地榆素H.11是地榆素H-2的四聚体,其结构如下: 贵州大学2008届硕士学位论文RI R2 R4120)H-3 G唧DP HHDP (21)11-6 G嘲DP髓DP (22)1t-8 H.H翻DP(231t!-9 H.HH.H (24)il-10 G唧DP (25)H.11为H.2的四聚体:(26)3,3。,4.三.甲基逆没食子酸; (27)地榆皂酸二内醋(TanakaT,eta1.,1984),其结构如下: !t0 OH H.H啊DP 删DP硼DP (27)地榆皂酸二内匿2 3,3’,4。三.甲氧基鞣花酸(TanakaT,eta1.,1984);(+).儿茶素;7-0.没食子酞 基(+).儿茶素;原矢车菊甙元B.3;3.O.没食子酰基原花色甙元B.3;原矢车菊甙元 C-2;棕儿茶素A.1;棕儿茶素B.3(李汉堡等,外国医学,医学分册):儿茶酚: 没食子酸(Gallicacid);逆没食子酸;没食子儿茶素;没食子酰葡萄糖(KosugeT, ct a1.,1984);丙氰定:丁香色原酮;4,6.六氢二苯.D.葡萄糖:赤芍素(GesaR, etal.,1992);大黄酚;大黄素甲醚;野樱皮甙(刘向前,1993);2,4.二羟基.6. 贵州大学2008届硕士学位论文甲基苯乙酮(TanakaT,eta1.,1984)。 1.3药理作用 地榆的生理活性较强,国内外研究也较多,主要有以下几个方面。 1-3.1止血作用 南云生等给小鼠灌服生地榆煎剂]09/kg,发现可以明显缩短出血时问和凝血 时间,与生理盐水对照比较(P<0.05)。研究还表明该类作用可能与其所含鞣质有关 (南云生,1990)。 1-3.2对烧、烫伤及伤口愈台的影响 陈壁等用10%地榆水提剂涂于太鼠实验性人工伤口,可使伤口面积迅速缩小, 且无感染发生,对伤口愈合有良好促进作用(陈壁等,1978)。 1.3-3抗病原微生物 体外抑菌实验表明地榆对金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌,溶血性链球菌,枯草 杆菌均有明显抑制作用,地榆煎剂可使噬菌体灭活,并可在菌体内抑制噬菌体繁 殖,但不能阻止噬菌体与细菌吸附(王溶生等,1983)。地榆、苦参合用治疗急性 茵痢疾有较好的疗效(肖培根,2002)。 1.3.4抗炎作用 太鼠腹腔注射地榆水提液或醇提液,可以迅速抑翩正常太鼠甲醛性足踱肿胀, 明显抑制棉球肉芽肿,抑翩率分别为73.3%和85.56%,同时研究还表明可以明显 抑制前列腺素E1引起的炎症渗出,使皮肤微血管通透性降低,从而减轻组织水肿 程度给小鼠腹腔注射地榆水提液或醇提液可抑翩实验小鼠巴豆油性耳肿胀,作用 与氢化可的松相当(叶聚荣,1985)。 1-3.5抗氧化作用 地榆提取物(含鞣质约46.3%)大鼠灌胃给药30d后造模,低剂量组(100mg/kg)、 高剂量组(200mg/kg)均能明显降低内毒素模型、肾缺血,再灌注模型血浆中3-硝 基酪氨酸、尿素氮和肌酐浓度,且存在量效关系,高剂量组与对照药氨基胍效果 相似,给药组肾缺血,再灌注模型的DNA断裂片段比例明显降低,提示地榆提取 物能对抗ONOO。的肾损害作用,抑制细胞凋亡。地榆提取物(含鞣质约(46.3%) 能逆转老化加速小鼠SAM种肾脏和肝脏中谷胱甘肽下降和二硫化谷胱甘肽上升 的趋势,血清、肾脏及肝脏中丙二醛含量下降到接近正常水平,提示地榆提取物 贵州大学2008届硕士学位论文能刺激SAM小鼠的抗氧化保护能力,具有改善氧化应激和氧化损伤的作用(聂淑 琴等,2001)。 1.3.6增强免疫功能 地榆水提液可以明显使实验刁i鼠增强2,。4.二硝基氯苯所致迟发型过敏反应, 使鼠耳重量增加,说明地榆可促进细胞免疫功能,具免疫增强作用(傅乃武,1994)。 1.3.7对消化系统的影响 地榆水煎液可以明显对抗小瞄刺激性泻药蓖麻油和太肠刺激性泻药番泻叶造 成动物实验性腹泻,表明有止泻作用地榆煎剂灌服小鼠对乙醇所致急性胃粘膜损 份有明显保护作用,可使溃疡面积显著缩小,与对照组比较有显著性差异 (P<0.001),表明有抗溃疡作用。小鼠口服地榆鞣质明显对抗氨基比林)台并亚 硝酸钠引起的急性肝损份,有效预防血清SGPT升高,提示地榆鞣质可阻止AP 在胃内的硝基化,对防止肝癌有一定意义(曾万玲等,1992)。 1-3.8对皮肤的影响 地榆50%乙醇提取物能明显降低内皮细胞内皮素转换酶(ECE.1a)的活性,能 显著减轻色素沉着,提示地榆提取物可作为增白剂。地榆的50%1,3.丁烯乙二醇 提取物不同浓度组均能抑制紫外线B照射后大鼠皮肤皱纹的形成、维持皮肤弹性、 抑制皮肤弹性纤维的卷曲,能改善UVB照射引起的慢性光损伤(孟燕彬等,2002)。 1-3.9对DNA酶的抑制作用 地榆中提取出的成分Sanguiin-H6(--聚鞣花鞣质),实验证实具有细胞毒性, 对DNA拓扑异构酶有抑制作用,Sanguiin-H6能广泛的抑制细胞内裂解物的形成, 对癌症具有抑制作用(孙盛,1999)。 1-3.10抗过敏作用 在国外,最近Shin,Tae.Yong通过PCA和compound48/80引发的过敏动物实 验模型,验证地榆根的粗提物抑制组胺介质的释放和TNF.a的产生,而TNF.a为 细胞过敏介质产生的诱导因子之一,证明地榆具有良好治疗即时型过敏的效果 (Shin,Tae—Yong et a1.,2002)。ImaokaK(1983)等人报道了地榆的提取物能够显 著抑制lgE类抗体,表明了地榆的提取物对lgE类抗体产生的过敏性疾病有疗效 作用,但对lgG类抗体无影响。LeeJ对可水解鞣质抑制C十激活透明质酸酶的 活性进行构效分析,27种可水解鞣质中没食子酸鞣质1,2,3,6.四.没食子酸葡 贵州大学2008届硕士学位论文萄糖抑制透明质酸酶的活性最强(LeeJ,LeeSH,MinKReta1.,1993)。ParkKH 通过小鼠的被动皮肤测试及由compound48/80和Ca2十引发的过敏测试,表明了地 榆提取物对肥大细胞有抑制作用,其主要成分为5.O.aoD.(3.C.羟甲基)呋喃来苏糖 基一p-D.(2.羟甲基)阿拉伯呋喃糖的双糖。这些研究都表明了地榆中确实存在抗过敏 作用组分。 1.4临床应用 1.4.1痢疾 一般可用鲜地榆,鲜龙芽草根各2 ̄3两,水煎服。方剂地榆甘草汤则用地榆甘 草研磨加砂仁煎服。主治血痢,泻痢之地榆丸则以地榆、当归、阿胶、黄莲、木 香、乌枚炼蜜为丸使用(中药研究文献摘要,1963)。 1.4.2溃疡病出血 沙报告单位地榆,每日四钱,煎后分两次服,治疗60例溃疡病大出血患者, 其中34例呕血者用药后31例(91.2%)立即停止呕血。56例便血者用药后41例 (73.2%)未再便血(李鸿勇等,1960)。兰州报告20例溃疡病大出血患者,服地榆 煎剂(地榆二两半,制成煎剂200毫升)一日三次,每次10毫升,全部病例用药 后即见效。哈尔滨报告溃疡病出血型用“溃疡粉”(乌贼骨、花蕊石各五钱,白芨、 地榆炭、煅牡蛎各三钱制成)获得良好效果(刁英智等,1965)。 1.4.3血崩 一般用地榆炭、香附炭、荷叶炭各五钱,水煎服。也可以用两半,醋和水各 半煎剂,日服一剂治愈功能性子宫出血(王立涛等,1965)。 1.4.4咯血 一般可用地榆甘草汤。江苏报告用复方地榆汤(地榆、仙鹤草、阿胶、麦冬、 沙参、白术、茯苓、桔梗、紫花、甘草)治疗20例肺结核咯血,止血效果较好(梁 燕飞等,1964)。 1.4.5烧伤 地榆于烧伤创面外用取得了较满意的效果。湖南医学院用地榆黄连粉(主要 是地榆)撒于创面,次日结痂,分泌物很快干燥,不用敷料。认为地榆有消毒杀 菌促进组织新生修复。观察了12例效果较好(邹建国等,1958)。福建报告用地 榆合剂(地榆、黄莲、黄柏、寒水石等量研磨粉,以100:1加冰片调茶油做成糊 贵州大学2008届硕士学位论文状,涂伤面每日一次,治疗三例效果很好。四川医学院的实验认为地榆对二、三 度烧伤创面有极显著疗效(蔡炼等,1959)。地榆对烧伤创面的疗效可能与其收敛、 止血、抗菌等综合作用有关。 1.4.6宫颈糜烂 地榆炭509,熟明矾及磺胺粉各259,用前加白芨胶浆成糊剂,用硝酸银腐蚀 宫颈糜烂部分后,涂以地榆糊剂,隔日一次,五次一疗程,根据220例观察,总 有效率为72.47%,轻、中度效果较好,重度深度炎症较难控制(刘线皮炎和湿疹 将地榆炙黄,研细末过筛,以凡士林配成30%药膏,外敷患部。敷膏前依皮 损的不同情况先以油类擦洗或l:8000高锰酸钾溶液湿敷。经治湿疹及湿疹样皮 炎,脂溢性湿疹,下肢静脉曲张性湿疹及糜烂感染型足癣等疾患共109例,结果 治愈47例,显效及有效50例。平均治愈日数为8.3天。以湿疹及湿疹样皮炎的治 愈率最高,脂溢性湿疹及下肢静脉曲张性湿疹共26例全部有效。实践证明,30% 地榆膏有止痒、收敛、消炎等作用。另有用生地榆l两,加水约600毫升,熬成 300毫升药液,冷却后湿敷患处流水部位(热湿敷可起反作用)。半小时后再浸再敷。 每天3--4次,连用3.-4天,直至不流水为止。适用于急性、亚急性、脂溢性湿疹, 婴幼儿湿疹,及慢性湿疹急性发作期。渗出较多时,待渗出减少后,可用地输20 两、煅石膏20两、枯矾1两研成细末混匀,调制成40--50%软膏外敷,每日l以 次。如遇亚急性、慢性湿疹皮损浸润或轻度肥厚时,可用地榆粉1.5两、密陀僧末 3两研匀加凡士林调成50---60%软膏外敷,每日l ̄2次(丁文华等,1959)。 1.4.8狂犬病 根据祖国古代医学记载以及1956年用加味人参败毒散(含生地榆)治愈二例 狂犬病,有认为,地榆可能对狂犬病有效(周艳,1959)。 1.5地榆属植物的研究发展趋向 地榆属植物中含有多种药用化学成分,主要为鞣质、皂甙和黄酮类物质。地榆 众多药理作用表明,其作用机理主要与所含的鞣质、黄酮类物质、皂甙的生理活 性密切相关。现对国内外研究的热点鞣质、黄酮类物质研究现状阐述如下:其中 鞣质是存在于自然界的一类比较复杂的多元酚类化合物,在过去植物化学成分研 究中常常作为制剂的杂质除去。随着研究工作的不断深入,鞣质越来越多地受到 lO 贵州大学2008届硕士学位论文 人们的关注。近几年国外对鞣质药理活性的研究很多,也取得了有意义的进展。 鞣质的药理活性除常见的收敛、抗菌消炎、止血、驱虫、止泻、抗多种病原虫感 染性疾病外,还表现在人们非常关注的抗肿瘤、抗人类免疫缺陷病毒、抗突 变、抗脂质过氧化,抗衰老、心血管病、改善肝肾功能、预防应激性胃肠损伤、’ 抗白内障、对重金属盐和生物碱中毒有解毒作用等方面有独到功效(肖培根, 2002)。在抗肿瘤方面,DNA拓扑异构酶(Topoisomerase)是近年来发现的肿瘤化疗 的重要靶点,而有文献报道,体外鞣质抗DNA拓扑异构酶II(ToplI)作用高于常规 临床化疗药物,其抑制程度与剂量成正比。此外,目前鞣质的抗艾滋病(AIDS)研 究令人关注,低分子量的水解鞣质,尤其二聚鞣花鞣质可作为口服剂来抑制AIDS。 鞣质包括水解鞭质和缩合鞣质,其中原花青素(PC)是从缩合鞣质独立出的一 大类物质,受到人们的极其关注。原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结 合而成。通常将二一四聚体称为低聚体(Procyanillolic oligomers,简称ope)将五聚 体以上的称为高聚体(Proeyanidolicpolymers,简称ppe)。据报道,低聚原花青素(opt) 拥有强有力的抗氧化能力,在体内其抗氧化、消除自由基能力是VE的50倍Vc 的20倍(吕丽爽,2000),能对自由基诱发的脂质过氧化及生物大分子损伤起到 有效的保护作用。低聚原花青素(opc)不仅能消除自由基,同时可以再生vC和VE。 低聚原花青素(opc)还具有预防高血压、抗动脉硬化(Teissedre PL,FrankelEN, WaterhouseAL,eta1.,1996)、抗血栓、抗胃溃疡(SaitoM,HosoyamaH,Ariga T,et a1.,1998)、抗菌、抗炎(张香文等,1999)、抗肿瘤(RicardodaslivaJM, DarmonN,FernandezY,eta1.,1991)、抗突变的生物活性(赵艳.2001)及皮肤 保健、美容等功能。国外已有多种保健产品上市,1995年曾被美国公众评为最受 欢迎的10种植物药之一。近10年来,低聚原花青素(opc)在欧美、日等国家的保 健品、化妆品领域得到广泛的应用,年销售超过1亿美元(段玉清,2002)。并享 有“皮肤维生素”和“口服化妆品”的美誉。在欧洲几乎每个人都把低聚原花青素看 作2l世纪抗衰老的物质。而我国关于原花青素的研究较晚,化妆品中应用更少。 国内外对黄酮类物质的研究很多,具有多方面的生理活性,引起了国内外的 广泛重视。特别在治疗冠心病、降血压、降血脂、降低胆固醇、抗氧化、治疗心 脑血管方面疗效显著。近年来对山楂、银杏、淫羊藿等黄酮成分的生理活性有很 多报道。有资料表明,山楂黄酮类物质对冠心病、心绞痛病人的总有效率为94.4%, 贳州大学2008届硕学位论文 对降低血脂总有效率为85%。有人研究了银杏叶和山楂叶提取物的抗氧化作用, 表明银杏叶和山楂叶提取物对氧自由基都具有较强的抑制作用(黄沛力等.1996)。 尤其心脑血管疾病作为世界三大顽症之一正在威胁着越来越多的人的生命,人们 期待着有效、廉价、低副作用的植物药的出现。 2长叶地榆的概况 长叶地榆是蔷薇科地榆属植物中的一 个常见种,习称绵地榆,为多年生草本植物。 主产地黑龙江、吉林、辽宁、山东、江苏、 浙江、云南、贵州等地,喜生于山坡、谷地、 草丛以及林缘和林内。 主治功能:具有凉血止血,解毒敛疮 之功效,常用于治疗便血,痔血,血痢,崩 漏,水火烫伤,痈肿疮毒等。(俞德俊等, 1979)。 图11长叶地榆 Pigl S.oJficinalicsLWlongifalia3研究目的及意义 地榆作为一种中草药在我国早己得到了广泛的使用,中华人民共和国的药典 (2000年版)收录本品为地榆(Sangu括orbaofficinalisL)和长叶地榆(Sangu缸orba o疥cialls Lvar longifoliaerO Yuet Li)的根茎。虽然她榆的化学成分分研已有报 道,但对于长叶地榆化学成分研究未见报道。 最早将地榆广泛应用于便血、痔血、血痢、崩漏、水火烫伤及痈肿疮毒的治 疗。随着近年国内外学者对病毒、肿瘤以及心脑血管疾病的研究的深入,经过大 量的药理研究表明。地榆鞣质对抗肿瘤、抗病毒以及抗氧化作用效果显著,能明 显缩短出血时间和凝血时阃,地揄有抗氧化、肪止细胞死亡、预舫衰老和去皱的 作用。 我国地榆资源丰富,分布广泛,主要以野生为主,栽培较少。而贵州盛产长 叶地榆,这一优势药用植物未能得到很好的开发和利用,造成了大量的野生长叶 地榆资源呈自生自灭状态,是对可再生资源的极大浪费。目前人们对“绿色”无毒、 无副作用的天然药物的青睐,如果能对其进行合理的开发和利用,能在医药、保 健品、化妆品以及食品添加剂上开发出一些列产品,提高其附加值。不但有益于 民,而且将会给贵州带来可观的经济效益。因此,对长叶地榆的有效化学成分的 12 贵州大学2008届硕士学位论文 筛选以及有效成分含量的测定进行全面研究是非常有必要和迫切的,其应用前景 也是十分广阔。 本课题拟采用黔产长叶地榆的根茎经溶剂提取后得到浸膏,运用传统经典的 柱层析分离方法,获得化学成分。借助波谱技术测定化合物的光谱数据和该植物 有效成分含量的测定。同时通过本文的研究,希望可以为黔产长叶地榆的活性物 质的筛选、质量控制标准、新产品的开发以及药材规范化种植等提供一定的基础 和依据,为开发地方资源做铺垫。 4设计思路 查阅大量文献资料及进行试验,得到最佳提取方法,并用小量提取物进行预 实验,测试长叶地榆含有的主要化合物的种类。再依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁 醇对乙醇浸膏进行萃取,重复3次。分别得氯仿萃取部分,乙酸乙酯萃取部分, 正丁醇萃取部分和水部分。再分别对氯仿、乙酸乙酯部分采用硅胶柱、TLC、 SehpadexLH.20葡聚糖葡凝胶柱层析、结晶重结晶等方法进行分离纯化。进行反 复分离纯化获得单体化合物,并运用各种波谱方法对各单体化合物进行结构鉴定 和有效成分含量测定。拟提取分离流程见图1.2 长叶地榆根茎 土干燥、粉碎 长叶地榆干粉 l依次用95%、80%、70%的工业乙醇浸泡72h, J合并提取液,减压浓缩至浸膏 浸膏 氯仿层部分 i进_步柱层析 乙酸乙酯部分正丁醇部分 柱层析户一步柱层析 水部分 进一步柱层析 图1.2长叶地榆乙醇浸膏萃取流程图Fig.1.2 Theextractionflowchartofethanolieextractasicca ofS.offieinalicsLvat longifalia 贵州大学2008届硕士学位论文 二、实验部分 1材料、药品及仪器 1.1植物材料 本实验所用植物材料为贵州长叶地榆的根茎,购自贵州省贵阳市花溪区药材 市场,经贵州大学廖汉明教授鉴定为蔷薇科地榆属长叶地榆(Sanguisorbaofficialis Varlongifolia(Bert)YuetLi)。室内风干、粉碎备用。1.2实验仪器 微型高速万能试样粉碎机(FW80型) 电子天平(FAl004型) 电热恒温鼓风干燥箱(Gzx-9140MBE) 离心机(LD4.2) 冷冻干燥机(LABCONCO) 紫外.可见分光光度计(T1901) 循环水多用真空泵(S皿.型) 旋转蒸发仪(R-200) 冰箱(BCD.208K/AN型) 超声波清洗机(DS.250A) 紫外.荧光灯(、FH.201型) 超导脉冲付里叶变换核磁共振仪 NOVA-400型) 500MHz超导核磁共振谱仪 (!OLECX.500型) 气相色谱.质谱联用仪(GC.MS5973型) 1.3化学试剂 工业酒精 无水乙醇 95%乙醇 甲醇 A.R A.R A.R A.R 天津市泰期特仪器有限公司 上海天平仪器厂 上海博达实业有限公司医疗设备 北京医用离心机厂 美国 北京普析通用仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司 瑞士BUCHI 青岛海尔集团 宁波市海曙达盛超声波仪器厂 上海顾村电光仪器 美国瓦里安公司 日本电子株式会社 美国惠普公司 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 14 贵州大学2008届硕士学位论文 正丁醇 A.R 丙酮 A.R 乙酸乙酯 A.R 三氯甲烷 A.R 石油醚 A.R 甲酸 A.R 正己烷 A.R A.R盐酸 5%亚硝酸钠 AR 10%硝酸铝 lmol/L氢氧化钠 醋酸锌 AR 氯化铵 AR 氨水 AR 乙二胺四乙酸二钠 AR 吡啶 A.R 氨水 A.R 二甲亚砜 A.R 硅胶(柱层析用) 100-200目和200—300目 硅胶(薄层析用) GF254 羧甲基纤维素钠 芦丁标准品 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂 天津化学试剂一厂‘ 重庆川江化学试剂厂 天津科密欧化学试剂开发中心 遵义四中化工厂 北京化工厂 河南焦作化工三厂 北京化工厂 遵义四中化工厂 天津科密欧化学试剂开发中心 天津科密欧化学试剂开发中心 天津科密欧化学试剂开发中心 青岛海洋化工 青岛海洋化工 湖南邵阳科仪有限公司 中国药品生物制品检定所 预实验分类显色剂: 通用显色剂:5%硫酸.乙醇溶液; 碘蒸气 Dragendroff试剂(碘化铋甲) 生物碱; Liebermann.Burchard试剂(醋酐.硫酸溶液) 黄酮3%三氯化铁甲醇溶液 贵州大学2008届硕士学位论文Kedde试剂 10%氢氧化钾 溴酚蓝溶液 2实验方法 强心苷 有机酸2.1成分的提取与分离方法 2.1.1长叶地榆的选取 在本研究课题中,我们选用贵州当地生长的长叶地榆根茎作为研究对象,主 要分离得到该植物的化学成分,并测定该植物根中的有效成分的含量。 2.1.2提取溶剂的选择 通过查阅大量相关文献以及结合本实验室的具体情况,本事实验采取乙醇浸 泡提取法,选择用90%、80%、70%的乙醇依次浸泡的提取方法。 2.1.3成分分离纯化方法的选择 在本课题中,主要采用液~液萃取和液~液分配色谱柱进行分离。用常用的氯 仿、乙酸乙酯、。正丁醇依次进行萃取,再分别对氯仿萃取部分、乙酸乙酯萃取部 分进行分离纯化。液~液分配色谱柱色谱的载体主要有硅胶、硅藻土、及纤维素粉 等。其中硅胶色谱柱因为分离效果好、成本低、操作简单等因素应用最为广泛, 因此本实验主要采用反复过硅胶柱进行分离,同时也采用SephadexLH.20葡聚糖 凝胶柱层析进一步纯化。过硅胶柱关键是选择分离效果好的洗脱剂体系,可以用 TLC的展开剂作为参考。另外,装柱也是较为关键的步骤,对分离效果影响较大, 在实验过程中主要采用干法装柱、上样。 2.1.4预实验 用乙醇提取少量的长叶地榆,制成溶液,用各种显色剂进行显色,以检查其 中可能含有的化学成分,以便进行下一步的提取分离实验。预实验的结果见表2.1 16 贵州大学2008届硕士学位论文 表2.1长叶地榆化学成分的检查结果 测试项目 实验或试剂名称 现象 结果 Mayer试剂 无沉淀 L-P_.例似Dragendorff试剂 无沉淀 Ninhydrin试剂 不呈现有色斑点 基酸,肽,蛋白质 双缩脲反应不显紫色反应 pn试纸检查 呈酸性 有机酸 溴酚蓝溶液有蓝色斑点 I%FeCl3试剂 墨绿色 酚类化合物和鞣质 FeCl3铁氰钾试剂蓝色斑点 Fehling溶液 未见沉淀 Molish试剂无紫红色斑点 泡沫试验有丰富泡沫 间二硝基苯试剂黄褐色 黄酮体浓氨水溶液 黄色荧光斑点 I%A1C13醇溶液黄色荧光斑点 香豆素与萜类化合物 间硝基苯试剂 紫红色斑点 强心苷Kedde试剂 不显色 10%KOH显色 挥发油,油脂一般检查 无油斑 2.1.5长叶地榆成分的提取将8公斤黔产长叶地榆的根、茎洗净,切片,日光下晒干,粉碎,然后用90%、 80%、70%的乙醇浸泡,置于常温下72小时,浸出液过滤,减压浓缩。重复3次 提取,每次浸泡时间为2~3天,滤液减压浓缩,浓缩物合并在一起。最后的残渣 弃之,将浸提液浓缩物置于电热线克。将浓缩所获 得的干燥样品用水分散,依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,分别得到氯仿部 分059)、乙酸乙酯部分(2079),正丁醇部分(2639)。其流程见图2.2。其中,我们 对氯仿相和乙酸乙酯相进行了分离纯化。 17 贵州大学2008届硕士学位论文 长叶地榆根茎 l干燥、粉碎 长叶地榆干粉l依次用95%、80%、70%的工业乙醇浸泡72h, 上合并提取液,减压浓缩至浸膏 浸膏 氯仿层部分 柱层析 ,减压浓缩 乙酸乙酯部分 柱层析 图2.2长叶地榆乙醇浸膏萃取流程图Fig.2.2 Theextractionflowchartofethanolicextractasicca ofS.o痂cinalicsL唧longifalia 2.1.6长叶地榆成分分离与纯化 2.1.6.1氯仿部分的分离与纯化 (1)柱层析分离条件的探索 取少量氯仿萃取物,用乙酸乙酯完全溶解,点样于自制硅胶薄层板(TLC薄 层检测),选取多种展开剂系统展开。我们选择了石油醚~乙酸乙酯、石油醚~丙酮、 石油醚~氯仿、氯仿~乙酸乙酯等系统进行展开。经多次重复试验,发现石油醚~ 乙酸乙酯和石油醚~丙酮两个系统都比较适于氯仿部分化合物的分离。综合考虑, 我们决定采用石油醚~乙酸乙酯系统,该系统相对毒性较小、安全性高、造价相对 低廉。 洗脱系统确定后,我们又选取不同体积配比的石油醚~乙酸乙酷进行TLC展 开试验。由于氯仿萃取物中成分较为复杂,各成分的极性差别较大,为使各成分 得到较好的分离并且尽可能快速分离,我们决定对其进行梯度洗脱。经大量探索 性试验,最终确定了以下梯度:石油醚~乙酸乙酯(V:V体积比,以下相同)1:0、 (2)氯仿部分柱层析分离通过薄层层析(TLC)确定洗脱条件后,我们采用柱层析进行分离。将159氯仿

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